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Glycobiologie végétale

Présentation

L’équipe de Glycobiologie Végétale s’intéresse à l’élucidation des mécanismes liés au métabolisme de l’amidon et sa régulation selon une approche de génomique fonctionnelle menée chez les organismes modèles Arabidopsis thaliana et Chlamydomonas reinhardtii. L’utilisation de ces deux organismes est complémentaire et permet d’allier les avantages de la génétique classique et de la génétique inverse.
L’amidon est le polysaccharide de réserve préférentiel des plantes. Il se présente sous la forme de granules denses, insolubles dans l’eau et partiellement cristallins dont la taille et la morphologie varie selon l’origine botanique et l’organe dont il est extrait. Typiquement, le diamètre d’un granule d’amidon varie de 0,5 à 100 µm. Les granules les plus volumineux sont isolés des tubercules de pomme de terre (Solanum tuberosum) et les plus petits, de microalgues vertes comme Chlamydomonas reinhardtii ou Ostreococcus tauri. L’amidon est synthétisé dans les feuilles pendant la journée pour être dégradé la nuit afin de fournir à la plante, l’énergie et le carbone organique nécessaires à son développement. Dans les organes de réserve (graines, tubercules par exemple), l’amidon, qui s’accumule progressivement au cours du développement de l’organe, sera dégradé lors de la germination, avant que la plante ne soit capable d’effectuer la photosynthèse. La synthèse de l’amidon se déroule dans le chloroplaste (tissus photosynthétiques) ou l’amyloplaste (tissus non photosynthétiques). Elle requiert un métabolite précurseur : l’ADPglucose dont la synthèse dépend d’une enzyme multimérique dont les régulations, très complexes, sont étroitement liées aux processus photosynthétiques. Les étapes ultérieures consistent à synthétiser les deux polysaccharides constitutifs du grain d’amidon : l’amylose et l’amylopectine. De fait, ces étapes qui peuvent être regroupées en trois processus majeurs (élongation, ramification, maturation), sont catalysées par de multiples formes enzymatiques génétiquement indépendantes. La même complexité est observée pour la dégradation de l’amidon (multiplication du nombre d’isoformes enzymatiques). Mais contrairement à la synthèse qui se déroule exclusivement dans le plaste (sauf la synthèse du précurseur chez les céréales), le processus complet de dégradation implique une phase qui se déroule dans le plaste et une autre dans le cytosol. La dégradation est assurée par des enzymes déramifiantes et dépolymérisantes (dans le plaste) et des enzymes de métabolisation des produits de dégradation de l’amidon (dans le cytosol). L’utilisation de la génétique inverse chez Arabidopsis thaliana a permis au cours des dernières années de progresser rapidement dans la compréhension des fonctions spécifiques des différentes isoformes. Néanmoins plusieurs points primordiaux restent encore à éclaircir tels que :

  • Les mécanismes liés à l’amorçage de la synthèse des glucanes et à l’initiation de la formation du grain d’amidon (ces 2 mécanismes peuvent être interdépendants ou non)
  • Le contrôle génétique du nombre et de la taille des grains d’amidon
  • Le contrôle du métabolisme en lien avec la division cellulaire et la division du chloroplaste (les divisions cellulaires et chloroplastiques étant concomitantes et corégulées)
  • La régulation générale du métabolisme et son intégration dans le métabolisme carboné de la cellule

Pour répondre à ces questions, l’équipe sélectionne et caractérise systématiquement des lignées mutantes pour chacun des gènes préalablement identifiés dans le génome nucléaire et pour lesquels une implication dans le métabolisme de l’amidon est prédite (= panel initial de gènes). L’analyse des phénotypes d’accumulation d’amidon nous renseigne sur la fonction probable des différentes enzymes. Par ailleurs, nous entreprenons la construction, par croisement, de lignées dans lesquelles nous combinons les mutations pour les gènes préalablement analysés (lignées doubles, triples, quadruples mutantes etc.). Ceci nous informe sur les niveaux de redondance fonctionnelle (pour les enzymes qui catalysent la même réaction enzymatique), mais aussi sur les interactions fonctionnelles et/ou physiques qui peuvent s’établir entre les enzymes (catalysant ou non la même réaction). De même, nous entreprenons à chaque fois que cela est nécessaire et possible, une étude complète des caractéristiques cinétiques des enzymes afin de les mettre en parallèle des phénotypes observés chez les mutants correspondants et en dégager ainsi la fonction intrinsèque. Par ailleurs, afin d’élargir notre vision du métabolisme de l’amidon (qui ne se limite pas a priori aux seuls gènes du panel initial), nous développons une approche d’analyse transcriptomique sur les mutants (simples ou multiples) précédemment sélectionnés et/ou construits par croisement. L’objectif dans ce cas précis est de nous éclairer sur toutes les modifications d’expression transcriptionnelle qui pourraient être induites par la ou les mutations, sur un ou des gènes potentiellement impliqués dans le métabolisme de l’amidon ou sa régulation et non retenus dans le panel initial. Ce type d’approche peut aussi nous permettre d’entrevoir les liens avec le métabolisme du carbone en général dans la plante (celui de la paroi par exemple) ou encore de cibler plus spécifiquement les combinaisons de mutations qu’il serait souhaitable de créer afin de produire des phénotypes nouveaux et potentiellement intéressants.

Enfin, nous développons une dernière approche qui consiste à reproduire in vitro le processus de synthèse de l’amylopectine afin d’en comprendre les mécanismes à l’échelle moléculaire. Cela passe par la mise au point d’un système simplifié faisant intervenir les principales activités enzymatiques de biosynthèse : élongation, ramification, déramification/maturation. Nous utilisons des enzymes commerciales d’origine bactérienne. Notre choix est pertinent dans la mesure où des modèles mathématiques indiquent que, si la déramification est indispensable pour organiser la structure cristalline de l’amylopectine, il ne semble pas nécessaire d’avoir une spécificité particulière de l’enzyme pour effectuer ce travail. Néanmoins, nous utilisons aussi des enzymes végétales recombinantes (maïs en particulier) car elles restent actives in vitro (ce qui n’est pas toujours le cas comme par exemple l’enzyme de débranchement recombinante d’A. thaliana). La connaissance des mécanismes précis de formation de l’amylopectine représente un préalable indispensable à une modification raisonnée et contrôlée de sa structure in planta pour satisfaire aux différentes applications industrielles.

Une thématique secondaire de l’équipe de Glycobiologie Végétale concerne l’étude structurale de la reconnaissance des effecteurs par les systèmes de sécrétion de type III chez Sinorhizobium fredii et Salmonella entérina. Les systèmes de sécrétion de type III (T3SS) permettent à certaines bactéries pathogènes d’injecter leurs facteurs de virulence dans le cytoplasme des cellules de l’hôte. Les T3SS sont formés de protéines conservées tandis qu’aucun motif conservé n’a été identifié chez les effecteurs. Il a été cependant montré qu’ils peuvent être reconnus et sécrétés par des T3SS hétérologues suggérant une universalité des motifs de reconnaissance. Nos récents travaux sur l’étude structurale d’un effecteur de Salmonella suggèrent pour la première fois,qu’un mécanisme basé sur l’organisation oligomérique des effecteurs, puisse être à l’origine de la reconnaissance du T3SS. Notre projet consiste à l’étude systématique de la structure de tous les effecteurs de type III d’une bactérie modèle (Sinorhizobium fredii) et de leurs partenaires de sécrétion dans le but de mettre en évidence les motifs communs de ces effecteurs et d’élucider les mécanismes moléculaires de leur reconnaissance par le T3SS.

Compétences et savoir-faire :

L’équipe a développé des compétences et expertises depuis une quinzaine d’années en :

  • Génétique et génomique fonctionnelle d’Arabidopsis thaliana et Chlamydomonas reinhardtii (sélection de mutants, criblage phénotypique, croisements, transformation). Récemment nous avons aussi acquis des compétences pour la manipulation et le criblage du blé et de la pomme de terre.
  • Enzymologie (dosages in vitro, zymogrammes, synthèse in vitro de polysaccharides, etc…)
  • Biologie moléculaire (clonage, expression hétérologue, PCR, Western blot, etc…)
  • Biochimie (purification des protéines natives ou recombinantes, dosage et purification d’amidon, caractérisation structurale de l’amidon
  • Analyse structurale des protéines (cristallogenèse, diffraction des RX, SAXE, etc…
  • Analyse transcriptomique et identification de réseaux de gènes ; nous avons établi un réseau collaboratif avec des équipes spécialisées en analyse transcriptomique.